Меченный тритием ОМг-ганглиозид (для
оценки активности изофермента А) или глобозид (для оценки активности изофер
мента В) инкубируют с образцом в течение 24 ч при 37° С в буфере рН 4,7 и
раствором таурохолата натрия для эмульгирования жиров. Образец инкубационной
смеси хроматографируют в тонком слое и с помощью В-счетчика оценивают
радиоактивность GM2-ганглиозида или тригексозилцерамида [Sandorff, 1970;
Sandorff, Wassle, 1971].
Изоферменты могут быть разделены с
помощью электрофореза [Friedland et al., 1970; Suzuki, Suzuki, 1970],
термоинактивации нзофермента А при 50° С и рН 4,4 в течение 1-4 ч [OBrien,
1970] или инактивации изофермента А при рН 2,8 в течение 5 мин при 37° С.
Источники фермента, характеристика двух
изоферментов и методы определения активности описаны ранее .
Недостаточность двух ферментов (вызов
теории один ген - один фермент) может быть объяснена тремя гипотезами.
1. Недостаточность изоферментов А и В
вызвана дефектом структурного гена, тогда как недостаточность изофермента А
обусловлена недостаточностью фермента, который определяется другим геном и
превращает в норме изофермент В в изофермент А (аналогично превращению
изофермента В в изофермент А нейраминидазой).
2. Оба изофермента - А и В - состоят из
двух субъединпц, одна из которых является общей для обоих ферментов.
Недостаточность изоферментов А и В вызвана повреждением общей субъединицы, а
недостаточность изофермента А - нарушением синтеза субъединицы, специфичной для
него. По этой теории можно предсказать существование соответствующего дефекта
субъединицы, специфичной для В, связанного с этим дефектом заболевания [Caroll,
Robinsor, 1972, 1973]. Это наиболее приемлемая точка зрения в настоящее время.
Фермент обнаружен в мозге, печени,
почках, селезенке, лейкоцитах, культуре кожных фибробластов и сыворотке крови.
Изоферменты В-галактозидазы, различимые с использованием
4-нит-рофенил-В-Б-галактозида и 4-метилумбеллиферил-B-D-галактозпда в качестве
субстрата, обсуждаются в главе о GMi-ганглиозидозе.