При типе Negro variant наблюдается
значительная недостаточность фермента в эритроцитах и лейкоцитах больных
гомозигот. Клинические проявления при этой форме бывают так же тяжелы, как и
при классическом заболевании. Однако у гетерозиготов при классическом
заболевании активность фермента в лейкоцитах снижена на 50% по сравнению с
нормой, тогда как при варианте Negro активность фермента в лейкоцитах
оставалась нормальной. У гетерозиготов при обеих формах наблюдалось снижение
ферментативной активности в эритроцитах на 50% [Mell-man et al, 1965].
Нормальный фермент и фермент Duarte
имели сходный антигенный состав, молекулярную массу около 90 000 и, возможно,
трехмерную структуру [Tedesco, 1972]. Описаны три метода для определения
активности фермента.
1. Галактозо-1-фосфат и УДФ-глюкозу
инкубировали при 37° и рН 7,5-8,7 с образцом, НАДФ+ в присутствии ферментов
глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и фосфоглюкомутазы. Глюкозо-1-фосфат
образовывался в ходе трансферазной реакции и в присутствии добавленных
ферментов окислялся до 6-фосфоглюконолактона с одновременным восстановлением
НАДФ + в НАДФ-Н. Содержание последнего определяли спектрофотометрически,
флуори-метрически и манометрически; в последнем случае для связывания с
кислородом в пробу добавляли митиленовый голубой [Issel-bacher, 1963; Beutler,
Mitchell, 1968; Westwood, Raine, 1973]. Описаны скрининг-тесты, основанные на
флоуриметрическом методе и восстановлении метиленового голубого в лейкоформу
[Beutler et al, 1964; Beutler, Baluda, 1966 а].
2. Галактозо-1-фосфат и УДФ-глюкозу инкубировали
при 37° и рН 7,5-8,7 с образцом. Через 15 мин белок осаждали кипячением и
оставшееся количество УДФ-глюкозы определяли с помощью
УДФ-глюкозодегидрогеназы. Последняя окисляла УДФ-глюкозу в УДФ-глюкуронат с
восстановлением НАД в НАДН, содержание которого измеряли спектрофотометрически
[Anderson et al., 1957; Bentler, Baluda, 1966].
