Ферменты, очищенные из эритроцитов и
плаценты человека, имеют идентичные рН-оптимумы, изоэлектрнческие точки и
молекулярные массы, но отличаются по сродству к субстратам и могут быть
разделены с помощью гель-декстрановой хроматографии [Blume et al, 1973].
Известны два метода определения
активности:
1. Галактозу инкубируют при 37° в
течение 60 мин в трис-буфере рН 8,0 с образцом, сернокислой магнезией и АТФ.
Количество остающейся галактозы измеряют при добавлении галакто-зодегидрогеназы
и НАД по изменению в поглощении НАД-Н при 340 нм. Количество образующегося
НАД-Н пропорционально количеству непрореагировавшей галактозы.
2. Галактозу-1-14С инкубируют при 37° в
трис-буфере рН 7,4 либо с суспензией эритроцитов и глюкозой или с гемолизатом,
АТФ и сернокислой магнезией в течение 2-60 мин. Меченый га-лактозо-1-фосфат
отделяют от инкубационной смеси с помощью ионообменной хроматографии и затем
оценивают радиоактивность этого продукта [Robinson, 1963; Ng et al, 1965;
Gitzelmann, 1967; Beutler et al, 1971].
Фермент найден в печени, эритроцитах,
лейкоцитах и культуре кожных фибробластов. При классической форме болезни
выявлена недостаточность фермента во всех исследуемых тканях [Kalckar et al,
1956]. Имеется несколько форм фермента, которые различаются электрофоретически
и при исследовании другими методами. Хорошо известный тип Duarte [Beutler et
al, 1965] отличается большей подвижностью, чем нормальный фермент, при рН 8,0 в
трис-буфере. При легкой форме заболевания у гомозигот выявляется половина
нормальной ферментативной активности в эритроцитах. Тип Los Angelos [Ng et al,
1973] также электрофоретически более подвижен, имеет высокую активность и не
связан с заболеванием. Тип Rennes [Shapira Kaplan, 1969] недостаточно активен,
электрофоретически менее подвижен и связан с клиническими проявлениями болезни
и галактоземией. Галактоземия наблюдается и при индийском варианте, связанным с
нестабильностью фермента [Chako et al, 1971].