Через 15-60 мин белки осаждаются
трихлоруксусной кислотой, а тирозин, находящийся в супернатанте, определяется
флуори-метрически или колориметрически после реакции с нитрозонаф-толом
[Kaufman, 1962; Bublitz, 1969].
Меченный 14С 2-фенилаланин инкубируют в
этой же системе, образующийся 14С-тирозин отделяют бумажной хроматографией,
элюируют и его содержание определяют с помощью жидкостного сцинтилляционного
счетчика [Kaufman, 1969].
Определение активности проводится в этой
же системе. В первом случае в инкубационную смесь не включается система
регенерации тетрагидроптеридина, реакция характеризуется увеличением поглощения
при 330-340 нм за счет образования дигидроптеридина. Во втором случае в
инкубационную смесь не вводят систему регенерации НАДФ-Н, реакция
характеризуется снижением поглощения при 340 нм за счет образования НАДФ+. В
третьем варианте с помощью кислородного электрода или манометрически
определяется фенилаланинзависимое потребление кислорода.
Эти методы ограничивают использование
грубых тканевых препаратов [Kaufman, 1957, 1959].
L-фенилаланин, меченный в параположенгш,
инкубируют при 30° С с образцом, в буфере рН 7,3, в присутствие
тетрагидроптеридина и НАД-Н. Реакцию останавливают кипячением в течение минуты
при 100° С. После охлаждения в инкубационную смесь добавляют ацетатный буфер рН
5,5 и N-йодосукцинимид. Йодирование тирозина, образованного в процессе
инкубации, освобождает тритиевую воду, которая после осаждения белков
трихлоруксусной кислотой отделяется от аминокислот фильтрацией через колонки с
Dowex и древесным углем, ее количество измеряют с помощью жидкостного
сцинтилляционного счетчика [Gurroff, Abramowitz, 1967].
Фермент найден в печени, эритроцитах,
лейкоцитах, фибро-бластах и плаценте.
Активность фермента в эритроцитах
достигает максимума немедленно после рождения и затем снижается до постоянной
величины в возрасте 3-6 лет [Ng et al, 1965].