Многочисленные примеры определения активности НАД+-зависимых ферментов, например лактатдегидрогеназы, приводились в предыдущих главах. В данной главе рассматривается метод определения активности аспартаттрансаминазы сыворотки, использующий НАД+-зависимую малатдегидрогепазу. Метод был предложен Karmen (1955) и модифицирован Henry и др. (1960). Как было указано, эта трансаминаза катализирует перенос аминогруппы от аспартата к 2-кетоглутарату с образованием глутамата и оксалоацетата.
Период преинкубации необходим для восстановления кофактора. Лактатдегидрогеназа - наиболее важный фермент в сыворотке, в присутствии НАД-Н будет восстанавливать эндогенный пируват. Раствор сыворотки, НАД-Н, малатдегидрогеназа и 2-аспартат в 0,067 М-фосфатном буфере рН 7,4 преинкубируют-ся при температуре реакции (обычно 25° или 37° С) в течение 10-20 мин. Реакция трансаминирования инициируется добавлением к инкубационной пробе а-кетоглутарата. Спектрофотометр должен быть оборудован термостатировап-пой кюветой, чтобы ферментативная реакция протекала при требуемой температуре. Кроме того, необходимо точно регистрировать время.
При малых сериях ферментных определении можно использовать секундомер. При большом объеме работы неизбежны ошибки. Использование регистрирующего спектрофотометра позволит решить эту проблему.
Сравнительно просто подобрать оптимальные условия, когда определяется активность НАД-зависимого фермента, такого, как лактатдегидрогеназа. Но даже и в этом случае будут возникать сложности, поскольку множественные формы этого фермента имеют различную субстратную специфичность. При определении активности аспартаттрансаминазы (когда используется сопряженная ферментная система) необходимо гарантировать достаточный избыток фермента-индикатора (малатдегидрогеназы) для реакции с быстро образующимся первичным продуктом (оксалоацетатом).
