Отклонения от кинетики нулевого порядка могут быть легко зафиксированы, и в этом случае проводятся необходимые мероприятия. Moss (1972), обсуждая методы анализа по двум точкам и методы с заданным временем инкубации заключает, что они широко используются в клинической энзимологии благодаря тому, что могут быть легко приспособлены к имеющемуся автоматическому оборудованию. Тем не менее методам непрерывного определения ферментативной активности следует отдать предпочтение по указанным выше причинам.
Типичными примерами методов с непрерывной регистрацией является метод определения активности щелочной фосфатазы, использующий хромогенные субстраты, и методы определения ак-тивпости других ферментов, в которых применяются в качестве-индикаторов реакции НАД+ и НАДФ+-зависимые ферменты.
В самых простых методах непрерывной регистрации концентрация продукта, образующегося в ходе ферментативной реакции, определяется физическими методами. Для определения активности щелочной фосфатазы в качестве субстрата используют р-нит-рофенилфосфат при рН 10. В процессе реакции освобождается р-нитрофенол, имеющий желто-коричневую окраску, нарастающую по мере накопления продукта. Таким образом, поглощение при 415 нм является мерой количества образующегося продукта и, следовательно, активности щелочной фосфатазы. Прямолинейная зависимость получепа в широком диапазоне активности и времени инкубации (10-20 мин). [Wilkinson et al., 1969]. При использовании этих методов не ставится отдельная контрольная проба, поскольку фиксируется изменение в поглощении во времени. Соответствующий метод определения по двум точкам Bessey и др. (1946) предполагает, однако, постановку дополнительного контроля, чтобы исключить влияние билирубина, присутствующего в сыворотке и поглощающего при 415 нм.
Этот метод может быть откалиброван в микромолях р-нитро-фенола, освобождаемого за мипуту (международные единицы) при помощи коэффициента молярной экстипкции р-нитрофенола при 415 нм.
