Медицинская диссертация

     Рекомедации по написанию, работа с литературой 
     Возможность заказать поиск защищенных диссертаций

Методы типа (а) обычно обозначаются как исследование путем измерения в двух точках, тогда как методы типа (б) часто, но не очень строго называются кинетическими методами. Все измерения каталитической активности зависят от кинетики, и методы типа (б) лучше классифицировать как методы непрерывной регистрации.
Типичными примерами определений по двум точкам является метод King-Armstrong для измерения активности щелочной фосфатазы [Moss et al., 1971] и метод Hughes (1962) для измерения активности креатинкиназы. В первом случае сывороточный фермент реагирует при 37 °С с фенилфосфатом (4,75 ммоль/л) в карбонат-бикарбонатном буфере (0,1 моль/л при рН 9,9 в течение 15 мип, после чего реакцию останавливают добавлением реактива Фолина или аминоаптипирипового реагента. Интенсивность образующейся окраски дает возможность определять количество фенола, освободившегося в течение 15 мин. Одновременно ставят контрольную пробу, в которой фенольный реагент добавляют сразу после сыворотки.
Принцип, предложенный Hughes (1962) для определения активности креатинкиназы, заключается в том, что сыворотка инкубируется при 37° С с субстратами, креатинфосфатом и АДФ в трис-буфере при рН 7,4 в течение 30 мин в присутствии активаторов - Mg++ и цистеина. Реакцию останавливают добавлением р-хлормеркурибензоата и гидроокисью бария - сульфатом цинка, которые осаждают белки. Образующийся креатинин определяют колориметрически с помощью реакции с а-нафтолдиацетилом. В контрольной пробе все реагенты добавляют в том же порядке, однако инкубация исключается.
Перед использованием подобной двухточечпой системы необходимо установить, что реакция следует кинетике нулевого порядка, т. е. количество продукта, образующегося в процессе реакции, нарастает прямолинейно, в течение периода инкубации. Это можно проиллюстрировать исследованием сыворотки с нормальной или умеренной увеличенной активностью.