Медицинская диссертация

     Рекомедации по написанию, работа с литературой 
     Возможность заказать поиск защищенных диссертаций

Однако использование сыворотки с высокой активностью может приводить к снижению концентрации субстрата до такой степени, что реакция не будет подчиняться более кинетики нулевого порядка. Для каждого метода этого типа необходимо найти верхний предел ферментативной реакции. С этой целью проводят серию определений с увеличивающимися количествами сыворотки и строят график зависимости между величиной наблюдаемой активности и объемом используемой сыворотки. В таких случаях обычно находится точка, при которой наблюдаемая активность уже не пропорциональна объему образца. Сыворотку с более высокой активностью надо исследовать повторно, при этом либо укорачивается период инкубации, либо используются меньшие объемы образца. Следует, однако, помнить, что использование малых объемов образца приводит к снижению концентрации белка в реакционной смеси, что, в свою очередь может неблагоприятно влиять на ход ферментативной реакции. Эта проблема также возникает, когда используются образцы, разведенные водой. Для устранения этих затруднений рекомендуется высокоактивную сыворотку разводить термоинактивированной нормальной сывороткой. Очень важно, однако, чтобы она не имела ферментативной активности и не содержала ингибиторов фермента.
Одним из недостатков некоторых методов определения активности ферментов по двум точкам является относительно высокий уровень реакции в контроле по сравнению с опытной пробой. Уже упоминались методы определения активности аспартаттрансаминазы, в которых образующийся оксалоацетат превращается в окрашенный 2,4-динитрофенилгидразон. Поскольку один из субстратов - а-кетоглутарат - образует сходное производное с 2,4-динитрофенилгидразином, то высоких величип в контроле не избежать. Более того, наблюдаются относительно высокие начальные и конечные концентрации субстрата по сравнению с концентрацией продукта. Однако коэффициент молярной экстинкции динитрофенилгидразона оксалоацетата значительно выше, чем у а-кетоглутарата, поэтому трансаминазпую активность можно определять по увеличению интенсивности окраски.