Эта цветная реакция широко использовалась для измерения креатинкиназной активности при помощи как прямой, так и обратной реакции [Ennor, Rosenberg, 1954]. Однако, так как равновесие сильно сдвинуто в сторону обратной реакции с креатин-фосфатом и АДФ в качестве субстратов, то обратное направление предпочиталось многими исследователями [Chappell, Perry, 1954; Dreyfus, Schapira, 1961; Hughes, 1962].
Рекомендуется введение в реакционную смесь тиоловых соединении, например цистеина, в качестве активаторов, однако подобные соединения могут влиять на ход цветной реакции [Ennor, Shocken, 1953; Hughes, 1962].
Oliver (1955) показал, что этот эффект может быть преодолен при помощи введения в реакционную смесь АМФ. Так как аде-нилаткиназа широко распространена в тканях человека и представлена в сыворотке крови, то присутствие ингибитора этого фермента является обязательным условием при выполнении точных измерений активности креатинкиназы. Количество используемого АМФ тем не менее является критическим моментом вследствие того, что избыток АМФ может ингибировать креатин-киназу.
Эта трудность преодолена в методе, предложенном Hess и др. (1968), которые включили сыворотку в преинкубационную смесь, но исключили АМФ и креатинфосфат. Реакция начинается добавлением креатинфосфата, а контрольное определение без субстрата дает возможность провести коррекцию на аденилаткиназнуго активность.
В методике Rosalki раствор креатинфосфата, АДФ, хлорида магния, глюкозы, НАДФ+ и АМФ в трис-буфере (рН 6,8) обрабатывается вспомогательными ферментами: гексокиназой и глюкозо-фосфатдегидрогеназой и преинкубируется при выбранной температуре реакции (25°, 30° или 37° С). Затем добавляют сыворотку и после лаг-периода (обычно около 5 мин, но иногда до 15-20 мин) уменьшение поглощения света при 340 им приобретает прямолинейную зависимость от времени. Активность рассчитывают исходя из микромолярного коэффициента поглощения НАДФ-Н.
