Признание того факта, что существует указанный
источник ошибки, привело к тому, что активность препаратов восстановленного
кофермента, выпускаемого рядом фирм, значительно возросла, а лиофилнзированнын
кофермент, поставляемый сейчас, почти свободен от вредных примесей. Тем не
менее даже кофермент наибольшей чистоты оказывает слабый ингибирующий эффект в
растворе или при воздействии влажпого воздуха.
Вопреки ЭТИМ неудобствам восстановление пирувата
остается папболее общеиспользуемым средством определения лактатде-гидрогеназной
активности . Сыворотка (или другой препарат фермента) преинкубируется в
соответствующем буфере, содержащем НАД-Н, что необходимо для завершения
реакций, катализируемых другими НАД
Н-зависимыми ферментами. Малатдегндроге-наза, например, будет
использовать НЛД-Н для восстановления следовых количеств оксалоацетата, который
может присутствовать в сыворотке. Поэтому если не выжидать некоторое время, эта
и ряд других реакций могут внести существенные искажения в определяемое
значение активности лактатдегидрогеназы. Иногда предполагается, что целью
преинкубации является утилизация эндогенного пирувата, но несмотря на то что
это несомненно имеет место, его исчезновение не имеет большого значения.
Пре-инкубация также дает возможность достичь необходимой температуры смеси.
Затем добавляют пируват и измеряют падение поглощения при 340 нм/мип,
предпочтительно при помощи регистрирующих спектрофотометров. Активность
фермента может быть рассчитана из микромолярной абсорбционной способности НАД-Н
(6,22).
Активность 2-гидроксибутиратдегидрогеназы может
быть измерена при добавлении а-кетобутирата к подобным преинкубационным смесям
[Rosalki et al., 1960; Shaw et al., 1974]. При этом надо контролировать чистоту
субстрата, так как при длительном хранении 2-кетомасляная кислота образует
продукт конденсации 2-этил-3-метилтетрагидрофуран-4,5-дион, который сильно
ипгиби-рует лактатдегндрогеназу [Wilkinson et al., 1968].
