Каждый
изофермент имеет свой характерный набор оптимальных условий, поэтому для ретивых
целей невозможен выбор условий, благоприятных для определения каждого
изофермента.
Часть методов, описанных в литературе. Все
методы можно разделить на два класса: 1) с постоянными и дискретными
измерениями в ходе реакции и 2) методы, согласно которым определяется
количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после
фиксированного инкубационного периода. Методы первого класса предпочтительны,
так как с их помощью можно постоянно измерять скорости реакции, тогда как
методы второго класса допускают
определение только средних скоростей. Методы, включающие измерения
скоростей реакции, делятся на два типа в зависимости от того, что используется
в качестве субстрата: лактат или пируват. Так как равновесие смещено в сторону
образования лактата, скорость обратной реакции выше, чем скорость прямой
реакции, поэтому активность фермента приблизительно в 2/2 раза выше при
использовании пирувата в качестве субстрата. В зависимости от изоферментного
состава оптимум рН для восстановления пирувата составляет 6,8-7,5, а скорость
прямой реакции достигает максимума при значениях рН от 8,8 до 10,0.
Методы, основанные на восстановлении пирувата,
критиковали из-за того, что фермент ингибируется избытком этого субстрата
[Thiers et al., 1958], но за время короткого периода реакции (1-3 мин)
количество восстановленного пирувата не изменяет значительно концентрацию
субстрата и нет обходимости начинать Реакцию при концентрациях, больших, чем
оптимальное. Более серьезным возражением против использования методов,
включающих восстановление пирувата, является присутствие примесей в НАД-Н
[Fawcett et al., 1961; Dalziel, 1961]. природа примесей пока не установлена, но
их присутствие в ряде коммерческих препаратов было подтверждено некоторыми
авторами [Strandjord et al., 1966; McComb et al., 1968].
