Из всех предложенных видов хроматографии
(адсорбционной, ионообменной, осадочной, распределительной и др.) наибольшее
применение получила распределительная (на хроматографической бумаге). Внедрение
автоматических анализаторов в значительной степени ускоряет и уточняет
определение аминокислот.
Для определения аминокислотного состава
можно пользоваться методом восходящей хроматографии по модификации Г. Н. Зайцевой и Н. Т. Тюленьевой.
Методика определения свободных
аминокислот сыворотки крови. Из испытуемой сыворотки осаждают спиртом белок (к
0,4 мл сыворотки добавляют 0,4 мл дистиллированной воды и 7,2 мл спирта), смесь
центрифугируют, над осадочную жидкость сливают в чистую пробирку и выпаривают
почти досуха; к остатку добавляют 0,2 мл спирта, тщательно перемешивают его,
набирают микропипеткой 0,1 мл и наносят на хроматографическую бумагу 5 - 6 раз
на одно и то же место после подсушивания. Таким же способом наносят смесь,
состоящую из 20 аминокислот (свидетели). В качестве растворителя для разгонки
аминокислот применяют смесь, состоящую из нормального бутанола, ледяной
уксусной кислоты и воды. Разгонку проводят 3 раза- по 6 час. методом восходящей
хроматографии в герметично закрытом сосуде.
После окончания хроматографии бумагу
просушивают при комнатной температуре и опрыскивают 0,2% раствором нингидрина в
ацетоне, затем помещают в сушильный шкаф на 10-15 мин. при 60С, где
проявляются- пятна аминокислот красно-фиолетового цвета. Окрашенные аминокислоты
вырезают, элюируют в насыщенном растворе азотнокислой меди (0,2 мл раствора
меди на 100 мл 75% этанола). Интенсивность нингидрогиновой окраски измеряют при
помощи ФЭК-М по специально посторенней градировочной кривой.
Калибровочные кривые строятся следующим
образом: сначала готовят 0,01 М раствор валина, треонина, лейцина,
аспарагиновой кислоты или других аминокислот. Соответственно взятым
концентрациям и полученным величинам оптической плотности строят калибровочные
кривые. Полученные результаты выражают содержание аминокислот в микрограммах на
1 мл сыворотки крови.
