При постановке реакции связывания
комплемента в объеме 1,25 мл титрование следует производить в присутствии
нормальной сыворотки (по 100% гемолизу). В штатив ставят четыре ряда пробирок
(10 пробирок в ряд): три ряда для титрования комплемента в присутствии трех
антигенов, четвертый - для титрования комплемента без антигенов. Кроме того,
ставят 3 пробирки для контроля трех
антигенов и по одной пробирке для контроля комплемента, гемолизина и
физиологического раствора на гемотоксичность.
В первый ряд пробирок разливают
разведенный 1:10 комплемент в дозах 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3, 0,36, 0,4, 0,5
мл, в эти пробирки доливают физиологический раствор, до 1 мл. Полученные смеси
разливают по 0,25 мл соответственно в стоящие сзади три пробирки. Затем во все
40 пробирок наливают по 0,25 мл разведенной 1:5 нормальной инактивированной
сыворотки. В пробирки первого ряда наливают по 0,25 мл разведенного по титру
антигена, во второй - антигена, в третий - антигена. Одновременно в контрольные
пробирки наливают по 0,5 мл соответствующего антигена.
В пробирки четвертого ряда доливают по
0,25 мл физиологического раствора. Наливают физиологический раствор и в
контрольные пробирки: 0,75 мл в
контроль; 0,75; 1,0 мл - в и по
0,5 мл в контроля антигенов.
Штатив с пробирками помещают на 45 мин.
в термостат, после чего приливают в каждую пробирку по 0,5 мл гемолитической
системы. Штатив с пробирками вновь помещают в термостат на 45 мин.
Титром комплемента является его
наименьшая доза, способствующая растворению добавленной гемолитической системы.
Для установления рабочей дозы к титру комплемента дают надбавку в пределах
15-30% в зависимости от хода гемолиза. В данном случае титр комплемента
равняется 0,3, а рабочая доза -0 ,36, то есть 3,6%. Если полный гемолиз получен
во второй пробирке, то рабочей дозой комплемента будет 2,0%, в третьей - 2,4%,
в четвертой -3,0%, в пятой -3,6%, в шестой - 4 %, в седьмой - 5,0 %.
Можно пользоваться сухим комплементом, сохраняющим активность в
запаянных под вакуумом ампулах в течение 4-5 лет (обычно в ампуле хранится 1 мл
комплемента). Для исследования 100 сывороток надлежит сухой комплемент из 5-6
ампул ссыпать в сухую пробирку, затем физиологическим раствором (5-6 мл) смыть
ампулы и в смывах растворить сухой комплемент.