Вариации спектрофотометрической процедуры для
определения лактатдегидрогеназы, при которых реакция пируват - НАД-Н
останавливается после фиксированного инкубационпого периода добавлением
р-хлормеркурийбензоата [Roabo, 1965] или боратио-го буфера [Maitinek, 1972],
несомненно упрощают технику определения, однако лишают возможности наблюдать
течение реакции.
Другой кинетический метод, использующий лактат в
качестве субстрата, требует значительного избытка НАД+ для получения
прямолинейного возрастания поглощения в ходе реакции. Как уже упоминалось,
оптимум рН этой реакции 9,0-10,0. В этих условиях НАД+ становится более
нестабильным [Lowry et al., 1961; Burch et al., 1967].
Первые колориметрические методы измерения
лактатдегидрогеназы были основаны на образовании
пируват-2-,4-диннтрофе-ннлгидразона, который дает интенсивное коричневое
окрашивание в щелочном растворе. Cabaud и др. (1958) выразили данные
собственных исследований в спектрофотометрическнх единицах при помощи
эмпирической калибровочной кривой, тогда как King (1956) измеряет число
микромолей образуемого пирувата и выражает свои результаты в международных единицах
(ME).
Эти и другие возможные колориметрические методы,
основанные па окислепии лактата и определении образуемого НАД-Н при помощи
тетразолий-формазановой реакции [Nachls et al., 1960; Raabo, 1963; Babson et
al., 1965; Briere et al., 1966; Spietel et al., 1972; Burd et al., 1973] или
при помощи реакции с 2,6-днхлорфеиолиндофенолом [Ells, 1961], имеют
существенный недостаток. Он заключается в необходимости относительно
длительного периода инкубации (10-15 мин), во время которого ничего неизвестно
о ходе ферментативной реакции. Напротив, постоянное или дискретное
регистрирование при спектрофотометрическнх измерениях через 1-3 мин дает
возможность отмечать отклонения от прямолинейного ответа (нулевой порядок
кинетики) .
Методы, основанные на флюоресценции НАД-Н при
длине волны возбуждения 340 нм, также получили некоторое распространение
[Laursen, 1959].
